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引物探針問題 怎樣消除引物二聚體

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實時定量PCR分析的部分實施需要進行優化，確保所有反應參數設置準確，從而獲得準確的結果 。熒光定量PCR常見的難點包括引物、探針、反應抑制和軟件分析 。今天，小姐姐分享她在引物和探針方面的經驗 。
【引物探針問題 怎樣消除引物二聚體】
實時定量PCR幾乎是現代分子生物學中最重要、應用最廣泛的核酸定量檢測技術 。成功的定量PCR實驗離不開準確的實驗設計和操作流程 。
引物二聚體引物二聚體的形成是最常見的問題之一 。當引物對之間的一些序列具有同源性時，可以形成引物二聚體 。如果引物在Chuangye.com的PCR反應過程中退火形成二聚體，Taq DNA聚合酶可以延伸二聚體形成比原始引物更長的產物，這在循環過程中更容易導致退火錯誤 。
問:引物二聚會引起哪些問題？
引物二聚體對反應的影響很大程度上取決于反應中使用的化學物質 。基于熒光探針的反應受引物二聚體的影響不大，這是因為探針退火和斷裂的現象很少發生在引物二聚體區域 。此時，引物的競爭是需要考慮的主要問題 ?；陔p鏈DNA結合染料的反應受引物二聚體的影響很大 。因為染料的結合模式是非特異性的，所以在反應過程中監測的熒光信號可以被增強 。這可以相應地改變Ct值，使結果偏離 。
問:如何確定是否存在引物二聚體？
凝膠電泳是顯示引物二聚體的一種很好的方法 。引物二聚體在凝膠底部形成擴散帶，通常低于100 bp 。單純凝膠電泳的缺點是靈敏度最低只有納克級，所以可能得不到結果 。
熔解曲線也是顯示引物二聚體的一種方法 。如果擴增具有優異的特異性，實時熒光定量PCR平板上每個反應孔的解離曲線將具有狹窄的單峰 。引物二聚體的熒光強度低，顯示出寬的“波形”，表明它在約70℃熔化(見圖1) 。

引物探針問題 怎樣消除引物二聚體

文章插圖

問:如何設計和優化實驗以避免引物二聚體？
最好在引物設計階段采取簡單的預防措施，避免從一開始就形成二聚體 。如果出現引物二聚體，有很多方法可以減少或消除反應中的引物二聚體 。
1.第一步是優化熱循環條件，主要是提高退火溫度 。大多數情況下，兩步循環(從95°C變性步驟直接到60°C退火和延伸步驟)有利于強擴增，因此引物設計中成功設定的退火溫度為60°C 。
2.它可以降低引物濃度，甚至有助于使用不同比例的正向引物和反向引物 。大多數情況下，每個引物的理想最終濃度為200~600 nM，但必要時可降至60 nM 。
3.鎂的最佳濃度一般為3 mM左右，超過這個濃度，引物二聚體容易形成 。
4.如果尚未評估引物形成二聚體的趨勢，則應進行補充和重新設計(如有必要) 。一般最好用熱啟動DNA聚合酶，在冰上進行反應 。
5.理論上，對于同一目標，應該同時檢測多個引物組 。事實上，這可以節省很多時間，因為如果這些引物中的一個可以立即工作，則可以減少優化過程中花費的時間 。
引物和探針的儲存引物和探針儲存不當會導致降解和特異性喪失，進而影響反應效率 。影響引物和探針穩定性的主要因素是儲存溫度、儲存時間、是否長時間暴露、儲存引物和探針的濃度以及儲存液的成分 。
問:如何長期保持引物和探針的穩定性？
保持引物和探針的穩定性有四個關鍵點 。凍干引物在儲存時間和溫度上具有更好的靈活性 。一旦引物重新溶解，應在-20℃下儲存，如果儲存超過一年，應監測其功能是否下降 。對于標記的引物和探針，應采取措施避免標記物暴露(例如，使用不透明的試管并將其置于黑暗中)，以延長其使用壽命 。
引物濃度也會影響其穩定性 。建議引物貯存濃度不低于10m；；事實上，在大多數情況下，100 M引物濃度更容易操作 。引物和探針也應分開儲存，以減少冷凍和解凍時間，特別是標記的引物和探針 。最后，TE緩沖液可以形成比水更穩定的環境 。此外，含有0.1 mM EDTA(標準TE中1 mM EDTA)的TE緩沖液是理想的溶液，因為某些PCR反應可能對EDTA有一定的殘留敏感性 。
NTC放大當引物二聚體形成時，如果使用與DNA雙鏈結合的染料，在NTC反應中也可以觀察到熒光信號 。在另一種情況下，在存在污染物的情況下，無論是基于探針或雙鏈DNA結合染料的反應，在NTC孔中也將觀察到引物二聚體的擴增 。這可能是一個隨機事件，并不是所有的NTC都會被放大，這通常是由不尋常的采樣錯誤引起的 。如果在每個NTC反應中發生擴增，很可能有一種或兩種試劑被污染 。

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