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穩定細胞系構建 細胞株構建

基因質粒轉染細胞株

細胞系構建(穩定細胞系構建)
構建穩定細胞植物的常用技術方法
1.基因過表達穩定細胞系的構建
(基因過表達多克隆細胞系構建服務，基因過表達單克隆細胞系構建服務):
過表達細胞系構建服務包括靶基因過表達慢病毒載體的構建、病毒包裝、細胞轉染和篩選 ?？蛻糁恍枰峁┠康幕虻腸DNA質粒和要構建的細胞系 。我們將根據您的要求完成目的基因過表達細胞系的構建和檢測，為您提供優質的基因過表達穩定細胞系 。
2.RNA敲除穩定細胞系的篩選
(RNA干擾基因敲除細胞系多克隆構建服務、RNA干擾基因敲除細胞系單克隆構建服務):
我們的RNAi敲除細胞系是基于慢病毒表達系統 。一般采用U6啟動子驅動的pLVshRNA-puro載體或pLVshRNA-EGFP(2A)puro載體構建RNA干擾穩定細胞系，其服務包括干擾載體構建、靶標篩選、干擾效率驗證和穩定細胞篩選克隆 。
3.CRISPR敲除穩定細胞系的構建服務；
隨著TALEN和Cas9/gRNA基因敲除系統的出現，靶向基因敲除的難度大大降低 。全新技術將基因敲除從昂貴耗時的ZNF系統變成了簡單的研究工具 。現在我們可以為Talen和Cas9/gRNA系統提供基因敲除服務 。包括基因敲除靶標設計、TALEN質粒組裝、Cas9/gRNA質粒構建和基因敲除效率驗證 。
穩定細胞系的篩選方法
1.質粒轉染后，用單克隆方法篩選穩定的細胞系:
大多數細胞的轉染效率較低 。對于基因過表達，如果轉染效率達到40%，則基因過表達是可以接受的 。然而，對于基因干擾實驗，對轉染效率的要求遠高于基因過表達，質粒轉染不能滿足要求 。
此外，質粒在細胞質中游離，降解快，長時間不能滿足檢測項目；質粒轉染整合的概率極低，構建穩定的細胞系費時費力，產量極低，因此往往需要選擇單克隆系 。
2.篩選穩定的病毒感染細胞系；
病毒感染法比質粒轉染篩選單克隆方法更方便高效，是目前穩定細胞系的主流篩選方法 。慢病毒具有高效整合、高效轉錄、高效表達、宿主范圍廣、感染效率高、與細胞染色體整合不需要基因重排等優點，是制備穩定細胞系的理想載體 。
穩定細胞株的一般服務流程
1.載體構建病毒包
一般來說，將人源化抗體基因轉移到慢病毒載體上，然后檢測質粒的表達，包裝得到過量表達目的基因的慢病毒質粒 。將慢病毒載體系統的包裝組分與用于包裝的載體組分一起轉染到293細胞中 。24至48小時后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，濃縮并測試滴度 。
圖1病毒包裝細胞感染
2.細胞轉染
真核表達載體常用的抗性標記有嘌呤霉素、潮霉素和新霉素 。首先確定嘌呤霉素/G418的篩選濃度和病毒轉染濃度，然后將病毒懸液轉染細胞24小時，用嘌呤霉素/G418篩選穩定的轉化子，用ELISA和WB鑒定 。
3.單克隆
利用Molecular ClonePix2系統，高通量自動篩選100-200個高水平分泌克隆，選出10個最佳高產克隆用于下一步穩定性試驗 。
4.細胞系的穩定篩選
幾代細胞系后，可能會出現遺傳不穩定 。我們選擇了最佳的10個克隆，經過10次傳代后，用qPCR和WB方法檢測細胞系的穩定性 。最后，我們提供了序列和載體的報告，三種最佳表達的細胞系，表達分析，穩定性測試報告和詳細的穩定細胞系構建報告 。

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