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婦科pcr檢查是什么意思，pcr檢查是什么意思( 三 )

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dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性 。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris 。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存 。多次凍融會使dNTP降解 。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配 。濃度過低又會降低PCR產物的產量 。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低 。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化 *** 通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本 。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的 *** 白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸 。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應 。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的 *** 溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接 用于PCR擴增 。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA 。
Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜 。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少 。
PCR反應條件的選擇
PCR反應條件為溫度、時間和循環次數 。
溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點 。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸 。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性) 。
①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因 。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響 。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗 。
②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素 。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合 。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞 。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長 度 。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想 。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性 。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合 。
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行 。
PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合 。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的 。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min 。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現 。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些 。
循環次數 循環次數決定PCR擴增程度 。PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度 。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多 。
PCR反應特點
特異性強 PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性 。
其中引物與模板的正確結合是關鍵 。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的 。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度 。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高 。

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