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婦科pcr檢查是什么意思，pcr檢查是什么意思( 二 )

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PCR技術基本原理
PCR技術的基本原理 類似于DNA的 天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物 。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板 。每完成一個循環需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝 。
PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升 。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算 。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數 。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值 。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應”，這種效應稱平臺期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素 。大多數情 況下，平臺期的到來是不可避免的 。
PCR擴增產物 可分為長產物片段和短產物片段兩部分 。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴增的特定片段 。短產物片段和長產物片段是由于引物所 結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在之一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒 有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段” 。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產物片段”)結合 。引物在與新鏈結合 時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的 “短產物片段” 。不難看出“短產物片段”是按指數倍數增加，而“長產物片段”則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用 。
PCR反應體系與反應條件
標準的PCR反應體系：
10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul
PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度 。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增 。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右 。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段 。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶 。ATGC更好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶 。
⑤引物3’端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗 。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列更好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處 。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性 。
引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以更低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會 。
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶 。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少 。

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